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                circPLCE1编码的NF-κB调控因子抑制结直肠癌进展
                栏目:最新研◥究动态 发布时间:2021-10-14
                circPLCE1编码的★一种新蛋白circPLCE1-411被鉴定为NF-κB激活的关∩键蛋白。机制上,circPLCE1-411......


                NF-κB信号的组成性激活在结直肠癌(CRC)的发生发展中起着关键作〒用。然而,NF-κB信号通路过度激活的潜在机制在很大程度上尚不清楚。circPLCE1编码的一种新蛋白→circPLCE1-411被鉴定为NF-κB激活的关键蛋白№。机制上,circPLCE1-411通过直接卐结合HSP90α/RPS3复合物促进RPS3从复合物中分离,促进了关键〖NF-κB调节因子RPS3的泛素☆依赖性降解,从而减少了CRC细胞中NF-κB核转位。在功能上,circPLCE1抑制CRC细胞中的肿瘤增殖和转移,以及患者来源的异种移植瘤和原位异种︻移植瘤模型。临床上,circPLCE1CRC组织中下调,并与晚期〖临床阶段和低生存率相关。本文于20218月发表在Molecular CancerIF=27.401)期刊上。


                技术路线



                结果:

                1CRCcircPLCE1的特征及』临床意义

                为了识别CRC中差异表达∮的circRNA,我们使Ψ 用正常的人类肠道上皮细胞系和CRC细胞系进行了总RNA测序。我们确定研究对象为circPLCE1 (hsa_circ_0019223,命名为circPLCE1)。我→们分析了85CRC样本中的circPLCE1表达,证实了88.2%(75/85)CRC患者中circPLCE1表达下调(1AB)。进一步分析显▃示,circPLCE1在晚期临床期或T期患者中表达下调(1CD)。使用qRT-PCR分析circPLCE1在正常人肠上皮细胞株和CRC细胞株中的表达水平差异,得到了相似∞的结果(1E)circPLCE1PLCE1外显子2反向剪【接而成。通过Sanger测序证实了circPLCE1的反向拼接连接(1F)PLCE1的环状」转录本只能通过扩增引物在cDNA中扩增(1G)circPLCE1还能抵抗RNase R酶切(1GH)。半衰期试验进一步表明,circPLCE1circPLCE1线性mRNA更稳定(1I)。通过核质量分离试☉验和荧光原位杂交(FISH)检测了circPLCE1的定位,结果显示circPLCE1CRC细胞的细胞╲质中富集(1JK)。此外,circPLCE1在临床晚期或T期患者中▲表达较低(1L)Kaplan Meier曲线▆结果显示,CRC患者circPLCE1表达较低与较差的生存率相关(1M)这些数据验证了circPLCE1的特征和№临床意义。




                2
                circPLCE1体外抑制CRC细胞增殖和△迁移

                为了阐明circPLCE1CRC中的功能,我们构建了稳定过ㄨ表达circPLCE1CRC细胞系。circPLCE1过◆表达抑制了CRC细⌒ 胞集落形成、球体形成和不※依赖于锚定的生长(2A-C)。此外,我们在两个患者来源□ 的器官(PDOs)中过表达了circPLCE1,结果︻也表明,circPLCE1降低了PDOs的生长(2D)。过表达circPLCE1也︾抑制细胞迁移和侵★袭(2EF)。此外,circPLCE1敲低显著促进了CRC细胞的生长、迁移和侵袭(2G-K)。综上所述,circPLCE1CRC细胞的增殖和迁移中发挥卐重要作用。




                3
                circPLCE1编码一种新的々蛋白circPLCE1–411

                为了研究CRCcircPLCE1的详细机制,我们首先使用编码潜能评估工具分析了circPLCE1的编码潜能,提示circPLCE1的蛋白编码概◤率大于0.999。接下来,我们︽分析了卐circPLCE1ORFcircPLCE1中存在一个潜在的跨越连接ORF编码一个411氨基酸蛋白(以下简称circPLCE1-411,图3A)。通▂过双荧光素酶分析验证了驱动ORF翻译的内部核糖体进入位点的活性(3B)。接下来,我们构建了flag标记的质粒以确定circPLCE1-411的存在。通过qRT-PCR检测circPLCE1和线性PLCE1的表达(3C)。此外,我们发现PLCE1抗体在circPLCE1-411中具有相同的免疫原序列(3D)Western blot结果显示,在不影响PLCE1表达的情况下,PLCE1flag抗体可在50 kDa左右检▼测到circPLCE1-411 (3E)。此外,qRT-PCRwestern blot检测表明,circPLCE1circPLCE1-411并不影响PLCE1的含量(3CE)。为Ψ了鉴定该蛋白,我们用转染了flag标记的circPLCE1载体的细胞裂解液进行免疫沉淀【分析(3FG)。结果证明circPLCE1编码了这种新蛋白(3H)。为了探索circPLCE1-411的潜在临床意义,我们通过western blot分析了CRC样本和正←常邻近组织中circPLCE1-411的表达。结果显示,circPLCE1-411在大多数CRC组织中下调(3I)。此外,circPLCE1-411表达与肿瘤的临床分期和T分期呈负相关(3JK)


                4
                circPLCE1通过编码circPLCE1-411抑制CRC细胞增殖和迁移

                为了探索circPLCE1-411的生物学功能,我们进行了〖细胞实验。结果表明,转染circPLCE1circPLCE1-411CRC细胞可︻抑制集落形成、球的形成、不依赖于锚定的生长和PDOs生长。然而,用带有ω起始密码子突变体的circPLCE1载体(circPLCE1-ATGmut)转染对CRC细胞增殖没有影响(4A-H)。此外,细胞迁移和伤口愈合实验也显示,转染circPLCE1circPLCE1-411载体⌒ 可抑制CRC细胞迁移和侵袭,而转染circPLCE1-ATGmutCRC细胞迁移没有影□ 响(4I-L)。这些数据表明,circPLCE1通过编码circPLCE1-411而不是circPLCE1circRNA形式来抑●制CRC细胞的增殖和迁移。


                5
                circPLCE1 - 411HSP90α/RPS3复合物结ξ合,促进泛素依赖的RPS3降解,抑制NF - κB信号通路

                根据前期研究和相关文献我们推测circPLCE1-411可能与HSP90α/RPS3复合物结合,调控NF-κB信号通路,从而抑制CRC的进展。我们在HCT8DLD1细胞中通过免疫沉淀鉴定了circPLCE1-411HSP90α/RPS3复合物之间的相互作用(5A)。我们发现RPS3蛋白水平随着circPLCE1-411表达的增加而显著降低(5B,上)。然而,RPS3 mRNA水平Ψ的丰度并没有随着circPLCE1-411表达的增加而改变(5B,底部)这提示circPLCE1-411可能通过转录后机制调控RPS3经蛋白合成抑制剂环己亚胺CHX处理后,与对照组相比,HCT8DLD1细胞中RPS3蛋白降解更快,circPLCE1-411表达增加(5C)。此蛋白酶体抑制剂MG132的作用减弱了circPLCE1-411RPS3蛋白水平的影响(5D)circPLCE1过表达的细胞中RPS3泛素化水∩平升高。相反,circPLCE1敲低后,RPS3的泛素化水平降低(5E)。接下来,我们用相同浓㊣度的HA-HSP90αHisRPS3Myc-HSP70质粒转染HEK293T细胞,但增加Flag-circPLCE1质粒的浓度用于←后续的免疫沉淀实验。结果表明,随着circPLCE1-411表达量〖的增加,RPS3HSP90α的互作性降低,而与HSP70的互作性增加(5F)。为了鉴定HSP90αRPS3circPLCE1-411相互作用的结构域,我们生成了HSP90α截断突变体,发现RPS3circPLCE1-411的相互作】用依赖于HSP90αN(5G)

                由于RPS3NF-κB的重要↑调控因子,我们进一步分析了circPLCE1NF-κB信号通路的影响。Western blot结果显示,过表达circPLCE1-411导致全细胞提取物中p-P65表达降低,细胞核中P65表达下调。正如预↓期的那样,核P65DNA结合活性也减弱了。相反,circPLCE1-411敲低♂则上调了全细胞提取物中p-P65的蛋白水平,增加了细胞︼核中P65的积累,增强了细胞核中P65DNA结合活性(5H-I)。综上所述,circPLCE1-411结合HSP90αN端,促进RPS3HSP90α/RPS3复合物的解离,导致RPS3的泛素依赖性降解,抑制NF-κB信号。


                6
                circPLCE1-411在体内抑制CRC生长◤和转移

                为了证实circPLCE1-411在体内的功能,我们建立了原位异种移植瘤模型,观察肿瘤生长和肝转移情况。我们的结果显示,载体组和circPLCE-ATGmut组均出现80%(4/5)的结直肠肿瘤形成,60%(3/5)40%(2/5)的肝转移。在circPLCE1circPLCE1-411组中,5只小鼠中有2(40%)形成了肿∑ 瘤较小的原位肿瘤,未发现肝转移(6A-C)。此外,我们分析了人HPRT mRNA在肝脏中的表达,证实circPLCE1-411诱导肝转移瘤负荷显著增加(6D)。为了进一步探索这些作用,我们应用◥了PDX模型来评估circPLCE1-411通过肿瘤内慢病毒注射的潜在疗效。结果显示,与载体和circPLCE-ATGmut慢病毒处理的肿瘤相比,circPLCE1circPLCE1-411慢病毒处理的肿瘤导致肿瘤生◎长明显放缓(6EF)。此外,我们分离了PDX肿瘤,并通过H&EISHIHC染色评估它们⊙。并发现circPLCE1circPLCE-ATGmut组的circPLCE1表达上调。circPLCE1circPLCE1-411组中RPS3p-P65的表达降低(6GH)。综合〓这些结果,我们确定了circPLCE1-411在体内CRC肿瘤生长和转移中的关键作用。


                   结论:
                circPLCE1编码的circPLCE1-411可与HSP90α/RPS3复合物结合,促进关键的NF-κB调控因子RPS3从复合物中解离,从而促〓进其泛素依赖性降解,最终导致NF-κB核易位减少。此外,circPLCE1表现出一种破坏NF-κB核易位的表观遗传机制,可作为一々种新的、有前景的♀治疗靶点和预后标志物。