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                外泌体传输的miRNA-335-5p通过靶向RASA1促进EMT以促进结直肠癌侵袭和转移
                栏目:最新研究动态 发布时间:2021-10-19
                了解 CRC 转移的确切分子机制对于确定新的诊断生物标志物和制定 CRC 患者的治疗策略非常重要。目前,有作者对这▼一机制进行了研究......


                结直肠癌 (CRC) 在世界㊣范围内普遍存在,其死亡率主要是由于ω 其转移到远处的关键器官而造成的。外泌体-microRNAmiRNA)分泌已被⌒表征为癌细胞间细胞间通讯的重要因素。 然而,癌症分泌的 miRNA 与结直●肠癌 (CRC) 转移的特异性相关知之甚少。因此了解 CRC 转移的确切分子机制对于确定新的诊断生物标志物和制定 CRC 患者的治疗策略非常重要。目前,有作者对这一机〓制进行了研究,该研究于20216月发表在《Molecular Therapy-Nucleic Acids》,IF8.886


                技术路线:


                研究结果:

                1. CRC 细胞外泌体的表征

                作者分离从CRC 细胞表面脱落的各种囊泡,通过电子显微镜、纳米颗粒大小电位分析和蛋白质印迹鉴定外泌体(图1A-1C)。为了确定外泌体是否可◥以被 CRC 细胞内化,用荧光染料※ PKH67 标记外泌体,然后将它们与 SW480 细胞共培养,结果显示 SW480 细胞表现出高吸收▓效率(图1D)。与 PKH67 标记的外泌体孵育 24 小时后,超过 90% SW480 细胞对 PKH67 荧光∴呈阳性,表明外泌体被 SW480 细胞内化。

                1 来自结直肠癌(CRC)细胞系的外泌体的特性


                2.
                转移性CRC SW620细胞分泌的外泌体ㄨ促进CRC细胞的迁△移、侵袭和EMT

                作者使用细胞系 SW480 SW620 作为→实验模型,通过CCK-8 24 小时、48 小时和 72 小时测定细胞∩活力。结果表明,SW480-exo SW620-exo 细胞对细胞生长没有显♂着影响(图 2A)。此外,平ζ板集落形成分析显示 SW480-exo SW620-exo 细胞之间的生长没有差异(图 2B)。然而,来自转移性 CRC SW620 细胞的外泌体通过 Transwell 测定显着促进了 SW480 细胞的迁移和侵袭(图 2C)。此外,与 SW480-exo 和对照组相比,SW620-exo 提高了 SW480 细胞的伤口愈合能力(图 2D)。蛋白质印迹分析以确定与 EMT 相关的蛋白质的表』达水平。结果表明,相对于 SW480-exo 处理,SW620-exo 处理显着增加波形蛋白、纤连蛋白和 N-钙粘蛋█白的表达并降低 E-钙粘蛋白的表达(图 2E),表明源︽自转移性 CRC 细胞的外泌※体在 SW480 中诱导了 EMT

                2来自转移性 CRC 细胞系 SW620 的外「泌体促进 CRC 细胞迁移、侵袭和上皮间质转化 (EMT)


                3. miR-335-5p
                在来源于转移性 CRC 细胞的外泌体中【高表达

                作者进行 miRNA 测序以确定 SW480-exo SW620-exo 中的 miRNA 表达谱。结果发现 SW480-exo SW620-exo 具有显着不Ψ 同的 miRNA 表达谱(图 3A),并确定了 77 miRNA 的倍数←变化大于 5(图 3B)。通过定量 PCR,证实 miR-335-5p SW620-exo 中的表达比在 SW480-exo 中更高(图 3C)。并使用来◤自TCGA数据库的 miRNA mRNA 表达数据,证实了 CRC 中的 miR-335-5p 相对于正常样本显着升高(图 3D),以及 miR-335-5p 高表达的病例的总体↓存活率较低(图 3E)。为了探索 miR-335-5p CRC 中的功能,作者对 miR-335-5p 高或低表达的№ CRC 样本中表达的基因进行了基因集富集分析 (GSEA) 分析。确定了两种生物学途径的显着富集:Ras 蛋白信号转导和 Ras 蛋白信』号转导的调节(图 3F 3G)。这些结果表明SW620外泌体具有较高水平的miR-335-5pmiR-335-5pCRC中的功能可能与Ras信号通路的激活有关。

                3 miR-335-5p SW620-exo 中的表达显着高于 SW80-exo


                4. miR-335-5p
                通过靶向RASA1促进CRC细胞的迁移和侵袭

                作者使用TargetScanmiRDB miRTarBase miR-335-5p 三种生物信息学算法预测潜在■的靶基因(图 4A)。从 TCGA 下载的数据分析表明,RASA1 的表达与 CRC 患者的 miR-335-5p 水平显着相关(图 4B)。图 4C 显示了通过生物信息学分析确定的 RASA1 3' UTR 中的假定的miR-335-5p 靶位点。 使用野生卐型 (WT) RASA1 3' UTR SW480 细胞中进行的荧光素酶报告实验,结果表明转染 miR-335-5p 模拟物〓后荧光素酶活性显着降低(图 4C)。 相比之下,突变 (mut) RASA1 序列的报告基因的荧光素酶活性不受 miR-335-5p 的影响(图 4C),表明 miR-335-5p 直接靶向 RASA1 3' UTR 的特定区域。为了确定 miR-335-5p RASA1 的影响,使用 Lipofectamine 3000 miR-335-5p 模拟卐物瞬时转染到 SW480 SW620 细胞中。用定々量逆转录酶 PCR (qRT-PCR) 和蛋▅白质印迹进行评估表明 mRNA RASA1 和蛋白质▂水平在模拟转染细胞中显着下调(图 4D)。 此外,miR-335-5p 转染增加◥了 Ras 蛋白的表达(图 4E)。 miR-335-5p 的上调可能伴随着 EMT 激活,如 SW480 SW620 细胞】中波形蛋白表达增加和 E-钙粘蛋々白表达降低所证明的(图 4F)。 此外,miR-335-5p 水平升高显着促进迁移和侵袭,而用 miR-335-5p 抑制剂抑制 miR-335-5p 显着抑制 CRC 细胞的迁移和侵袭(图 4G 4H)。

                4 miR-335-5p 通过靶向 RASA1 抑制 CRC 细胞迁移、侵袭和 EMT


                5.
                外泌体传★递的miRNA-335-5p通过靶向RASA1促进CRC细胞迁移、侵袭、EMT和转移

                作者用 miR-335-5p 模拟物或←阴性对照 (NC) 转染的 SW480 细胞的条件培养基中收集外泌体。使用 qRT-PCR 检测这些外泌体中 miR-335-5p 的水平。结果显示含有模拟物(miR-335-5p 模拟物-exo)的外@ 泌体显着促进了 SW480 SW620 细胞的迁移和侵袭(图 5A 5B),并且还№降低了 RASA1 蛋白表达并增加了 Ras 蛋白表达(图 5C)。此外,miR-335-5p 模拟物-exo抑制 EMT,如上皮标志『物 E-钙粘◆蛋白的表达降低和间充质标志物波形蛋白的表达增加(图 5D)。最后,用 miR-335-5p 模拟物-exo处理∮的细胞显示出更强的体内转移促进作用(图 5E 5F),肺表面宏观结节的数量急剧增加。这些结果表明,外♀泌体介导的 miR-335-5p 穿梭可能会加速 CRC 细胞的体外迁移和侵袭以及体内转移,同时伴随√着 Ras 信号和 EMT 的激活。

                5 外泌↓体传递 miRNA-335-5p促进CRC细胞侵袭、转移和EMT,并降低RASA1水平


                6. RASA1
                的上调消除了外泌体miR-335-5pCRC细胞迁移和侵袭的▲促进作用

                为了进▃一步确定 RASA1 CRC 细胞中的潜在功能,使用慢病毒载体建立〓了过表达 RASA1 的稳定 SW480 细胞系。 如图 6A 6B 所示,在用表达 RASA1 的慢病毒载体(lenti-RASA1SW480-RASA1)转染的 SW480 细胞中,实时 PCR 和蛋白质印迹验证了 RASA1 mRNA 和々蛋白质的过表达。 在过表达 RASA1 的细胞中,Ras 和波形蛋白的蛋白质水平显着下调,而 E-钙粘蛋白上调(图 6C)。 此外,与 SW480 载体对照相比,SW480-RASA1 的迁移和侵袭能力显着降低△(图 6D)。

                接下来研究 RASA1 是否参与了↓ CRC 细胞中外▓泌体 miR-335-5p 对迁移、侵袭和 EMT 的诱导。 蛋白质印迹分析显示,miR-335-5p模拟物-exo增加了Ras和波形蛋白的蛋白水⊙平,但降低了RASA1E-钙粘蛋白的蛋白水平; 对于 RASA1 过表达,观察到这些蛋白质的反『向表达趋势(图 6E)。 此外,RASA1 过表达逆︼转了 miR-335-5p模拟物-exo诱导的 SW480 细胞迁移和侵袭(图 6F)。 这些结果表明〒外泌体 miR-335-5p 可能通过靶向 RASA1 诱导迁移、侵袭和 EMT

                6 RASA1异位表达抑制CRC细胞迁移和侵袭,消除外ξ 泌体miR-335-5p对细胞迁移和侵袭的促□进作用


                结论:

                该研究▼揭示了外泌体 miR-335-5p CRC 转移中的新功◢能,并阐明了外泌体包裹的 miR-335-5p 通过◆直接靶向 RASA1 促进 CRC 细胞侵袭、转移和 EMT 转化。 这些发现强烈表明外↑泌体 miR-335-5p 可能是一种预后生物标志物,并为解决 CRC 转移提供有价值的治疗策ζ略。


                参考文献:

                Sun X, Lin F, Sun W, Zhu W, Fang D, Luo L, Li S, Zhang W, Jiang L. Exosome-transmitted miRNA-335-5p promotes colorectal cancer invasion and metastasis by facilitating EMT via targeting RASA1. Mol Ther Nucleic Acids. 2021; 24:164-174. doi: 10.1016/j.omtn.2021.02.022