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                组织中细胞外囊泡的分离方法

                栏目:最新研究动态 发布时间:2022-09-28
                在此总结一种优化后的从组织中分离EVs的方法。优化主要是在黑色素瘤转移组◣织上进行的,但该方案已应用于其他几种类型的癌症......

                细胞外囊泡(EVs)是一种异质性的双层膜◣纳米粒子,在细胞间的信息传递中起☆着重要的作用。EVs可以介导肿瘤细胞迁移、侵袭、血管生成和细①胞存活。此外,来自多种类型癌症的EVs已被证明№具有诊断和预后价值,这可能会改善未来的癌症治疗方案。根据其生物起源和大小的差异※,EVs通常被分为两个亚组,微泡和外泌体↑。微泡由质膜上出芽形成,其直径」约为100-1000 nm。外泌体在多泡小体中产生,并通过胞吐途径被◤释放到细胞外部,其直径约为30-200 nm。迄今为止,大多数的EVs研究都是□在细胞系上进行的,但对这些研究如何代表EVs在体内的特征知之甚①少。在此总结一种优化后的从组织中分离EVs的方法。优化主〖要是在黑色素瘤转移组织上进行的,但该方案已应用于其他几种类型的癌症以及小鼠和人类的健康组织。详细操作步骤如下(图1):

                1. 收集样品

                收集组织后,将其保存在冰上的PBS中,然⌒ 后立即进行EV分离处理。

                2. 分离组织

                将组织轻轻地分解成小块(2×2×2 mm)

                3. 酶的孵化

                将分▼解后的组织与胶原酶DDNase I37℃下孵育30 min,在旋转搅拌机上以24 rpm/min的速度轻微〗搅拌,这一步骤使EVs从包裹它们的组织碎片中】分离出来。

                4. 过滤

                采用70 μm孔径过滤器,通过过滤步ぷ骤去除最大的元素。

                5. 差速离心

                剩余液体分别用300 g2000 g差速离心10 min,以∩清除细胞和组织碎片。将上清液16,500 g离心20 min收集大型EVs(lEVs)的粗馏分,118,000 g离心2.5 h收集小型EVs(sEVs)的粗馏分。

                6. 密度梯度

                为了进一步处理,lEVs和sEVs装载在单个碘二甲醇密度梯度(OptiPrep)上。将粗制EVs溶解在60%(wt/vol)OptiPrep溶液中,然后在其上放置一个间断的OptiPrep梯度溶液(35%、30%、28%、24%、22% × 2和20%(wt/vol))。186,000 g离心16 h后,共收集4个EVs亚种群。两个EVs亚种群被命█名为“大、小低密度(LD)EVs”,从20-22%(wt/vol)碘二醇层的界面收集(约1.111-1.121 g/cm3),另外两个亚︻种群称为“大、小高密度(HD)EVs”,从30-35%(wt/vol)碘二醇层的界面收集(约1.163-1.189 g/cm3)。


                1. 组织衍生EVs的分离□ 程序示意图概述