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                circCRKL是一种来源于CRKL的环状RNA,通过海绵化miR-877-5p调控BCR-ABL,促进慢性髓系白血病细胞增殖

                栏目:最新研究动态 发布时间:2022-09-30
                目前有□ 研究揭示了circCRKL在BCR-ABL+细胞中特异表达并通过诱变miR-877-5p调控BCR-ABL表达水平,这表明靶向......


                BCR-ABL融合蛋白是导致慢性粒细胞白血病(CML)发生的关键因素。伊马替尼(IM)是一种靶向BCR-ABL抑制剂,可达到完全缓解。然而,缓解失败是由于继发性BCR-ABL突变引起的获得性耐药,这强调了对新型BCR-ABL靶向策略的需求。近年来研究发现,来源于肿瘤相关基因的环状RNA (circRNA)可能是相关肿瘤的治疗靶点,但在CML中,这类circRNA的作用尚不清楚。目前有研究揭示了circCRKL在BCR-ABL+细胞中特异表达并通过诱变miR-877-5p调控BCR-ABL表达水平,这表明靶向circCRKL联合IM治疗可作为一种潜在的CML患者治疗策略。该研究发表在《Journal of Translational Medicine》,IF: 8.44。


                技术路线:



                主要研究结果:

                1. circCRKLCML细胞系和临床样本中的特征

                为揭示circCRKLCML中的潜在作用,采用RT-qPCR检测6例CML患者和3例正常供体BMMCs中circCRKL的表达。相对于正常供体,circCRKL在CML患者中大量表达(图1 A)。BCR-ABL+细胞系(K562、K562/G01、KCL22和SupB15)与BCRABL -细胞系(TK6和THP-1)进行比较时,circCRKL在BCR-ABL+细胞系》中的表达显著增高(图1B)。这些结果提示circCRKL与BCR-ABL之间可能存在联系。生信信息学分析,发现circCRKL是一个466 nt的circRNA,由pre-CRKL的2外显子反向剪接,采用Sanger测序确定环化位点(图1C)。RT-qPCR和RNA分离检测结果发现,CML细胞中circCRKL在细胞质中的表达水平高于细胞核中的表达水平(图1D, E),荧光原位杂交(FISH)进一步证实了这一结果(图1F)。RNase R分析显示线性CRKL的表达显著减少,而circCRKL没有变化,表明circCRKL在CML细胞中是稳定的(图1G, H)。放线菌素D处理,确定了circCRKL和线性CRKL的半衰期,发现circCRKL的半衰期比线性CRKL的半衰期更长(图1I, J)。circCRKL是一种稳定的circRNA,定位于CML细胞的细胞质并呈高表达,提示circCRKL在CML中具有潜在作用。


                1BCR-ABL+细胞系和CML样品中识别和表征circCRKL


                2. circCRKL促进体外BCR-ABL+细胞增殖

                通过功能缺失试验探讨circCRKLCML中的生物学作用。构建circCRKL敲低CML细胞,CML细胞中的circCRKL表达明显受到抑制,而线性CRKL表达不受影响(图2A, B)。CCK-8和集落形成实验发现,抑制circCRKL显著降低了CML细胞生长(图2C?F)。流式细胞术检测显示,circCRKL沉默减少了S期细胞的数量(图2G, H)。综上所述,在BCR-ABL+细胞中,circCRKL是特异性需要的,抑制circCRKL可抑制增▲殖。


                2 circCRKL体外促进CML细胞增殖


                3. circCRKL沉默可在体内损伤CML细胞的肿瘤发生

                Sh-NCsh-circCRKL慢病毒感染的K562/G01细胞分别静脉注射到免疫缺陷NOD/SCID小鼠体内,建立了CML小鼠模型。与预期的↑一样,对照组小鼠的白细胞计数比敲低组小鼠增加更多,但没有明显的差异(p=0.0586)(图3)。此外,与sh-NC组小鼠相比,敲低circCRKL减轻了脾肿大,但肝脏重量没有明显缺陷(图3B, C)。为评估白血病细胞的浸润,在小鼠骨髓、肝脏和脾脏中进行瑞氏染色。结果显示,sh-NC组异种移植模型中有更严重的浸润(图3D),苏木精/伊红(HE)染色也证实了这一点(图3E)。免疫荧光显示circCRKL沉默小鼠中BCR-ABL的水平要低得多(图3F)。综上所述,circCRKL在体内可以促进CML的恶性进展。


                3 circCRKL在体内促进CML细胞增殖


                4. circCRKL调控BCR-ABL的表达,miR-877- 5pcircCRKLBCR-ABL的靶点

                western blot显示抑制circCRKL的细胞中BCR-ABL和c-ABL蛋白水平降低(图4A)。免疫荧光法的结果与上述结果一致(图4B)。RT-qPCR表明,敲低circCRKL降低了BCR-ABL mRNA的表达(图4C),表明circCRKL可能在mRNA水平调控BCR-ABL。然而,circCRKL控制BCR-ABL的机制尚不清楚。

                circCRKL主要存在于CML细胞的细胞质中,这是circCRKL发挥miRNA海绵功能的关键前提。因此,从三▃个数据库(circInteractome、circBank和ENCORI)中筛选了circCRKL的下游miRNA(图4D)。ENCORI,TargetScan和miRwalk数据库预测与ABL结合的miRNAs。然后将circCRKL和ABL的miRNAs进行重叠(图4E)。在候选miRNA中,miR-877-5p是一↓种独特的包含circCRKL和ABL-3'UTR结合位点的miRNA(图4F),这是通过双荧光素酶报告基因检测证实的。当miR-877-5p异位表达时,野生型circCRKL报告基因的荧光素酶活性显著∞降低,但突变型报告基因的活性未受影响,这表明circCRKL可能与miR-877-5p在特定位点发生相互作用(图4G),miR-877-5p和ABL之间也观察到类似的结果(图4H)。RNA pull-down实验进一步验证circCRKL与miR-877-5p的结合。RT-qPCR显示miR-877-5p在K562/G01细胞中被circCRKL探针特异性富集(图4I)。此外,先前的研究已经注意到AGO2对于circRNA充当miRNA海绵的重要性。在此,进行了anti-AGO2 RNA免疫沉淀,发现circCRKL和miR-877-5p都可以相互作用,这意味着circCRKL可能充当miR-877-5p的海绵(图4J)。


                4 circCRKL沉默CML细胞中BCR-ABL水平下调


                5. miR-877-5p通过调节抑制CML细胞增殖BCR-ABL

                为了明确miR-877-5pCML中的生物学相关性以及BCR-ABL是否受miR-877-5p的调控,测定了CML患者BMMCs中miR-877-5p的表达水平(图5A),然后分别使用抑制剂或模拟物敲低或过表达miR-877-5p。通过RT-qPCR检测抑制剂或模拟物对CML细胞中miR-877-5p的影响(图5B, C)。抑制miR-877-5p后,BCR-ABL mRNA表达显著上调,而过表达miR-877-5p后,BCR-ABL mRNA表达显著降低(图5D)。同样,western blot显示抑制miR-877-5p可增强BCR-ABL蛋白水平,而过表达miR-877-5p则表现出相反的作用(图5E)。CCK-8(图5F, G)和集落形成实验(图5H, I)显示,抑制miR-877-5p刺激CML细胞增殖,而miR-877-5p过表达则相反。综上所述,这些发现揭示了miR-877-5p是BCR-ABL的负调控因子。


                5 miR-877-5p调控BCR-ABL表达


                6. circCRKL通过海绵状miR-877-5p调控BCR - ABL促进CML细胞增殖

                共转染shcircCRKLmiR-877-5p抑制剂进行挽救实验:CCK-8和集落形成实验显示,敲低miR-877-5p明显恢复了在CML细胞中抑制circCRKL引起的生长ζ抑制(图6A-D),改善了circCRKL抑制导致的BCR-ABL水平降低(图6E)。共转染sh-circCRKL和miR-mimic的CML细胞中BCR-ABL蛋白水平低于sh-circCRKL+mimic-NC细胞(图6F)。综上所述,这些结果证明了circCRKL通过调控miR-877-5p介导的BCR-ABL促进CML细胞增殖。


                6 circCRKL吸收miR-877-5p增强BCR-ABL,加速CML细胞增殖


                7. circCRKL被敲除时,K562/G01细胞对伊马替尼更敏感

                考虑到伊马替尼耐药细胞株K562/G01circCRKL表达水平高于K562细胞,推测circCRKL与伊马替尼耐药性之间可能存在联系。CCK-8法测定K562或K562/G01细胞对伊马替尼的半最大抑制浓度值(IC-50)(图S2A)。随后,检测稳定敲低circCRKL和circCRKL野生型K562/G01细胞经伊马替尼处理48 h后的细胞活力并计算IC-50值。数据表明,circCRKL沉默显著降低了细胞活力↙,并且IC-50值同时降低(图S2B)。流式细胞仪显示,敲低circCRKL可促进伊马替尼处理的K562/G01细胞的凋亡(图S2C)。抑制或过表达」miR-877-5p对K562/G01细胞IC-50值没有明显影响(图S2D)。之前的研究已经将Wnt通路与伊马替尼耐药联系在一起,相应的,相关标志物包括CTNNB1和c-Myc也通过western blot检测。数据表明,在circCRKL敲低的K562/G01细胞中,CTNNB1和c-Myc均有明显缺失(图S2E)。综上所示,circCRKL可能通过介导Wnt/β-catenin信号通路调控K562/G01细胞对伊马替尼的敏感性。

                S2 circCRKL敲低可改善伊马替△尼耐药细胞株K562/G01的敏感性


                结论:

                该研究揭示了由CML相关基因CRKL生成的circCRKL通过吸附miR-877-5p来维持BCR-ABL的表达水平,从而促进CML细胞增殖(图6G),揭示了circCRKL在伊马替①尼耐药细胞中发挥关键作用(图S2),这为缓解CML患者的耐药提供了一个新的视角。然而,circCRKL参与伊马替尼耐药的分子基础仍需进一步研究。总之,circCRKL可以引领CML治疗靶点的进展。