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                科技服务 > 功能机制研究服务 > microRNA整套技术服务(靶基因功能验证服务,报告基因载体,过表达载体,稳转细胞株等等)

                microRNA整套技术服务(靶基因功能验证服务,报告基因载体,过表达载体,稳转细胞株等等)

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                 microRNA靶基因验证实验 

                当前,microRNA对靶基因的功能研究十分热ω门。利用荧光素酶报告基因检测实验寻找或验证microRNA对靶点作用性是不●可或缺的实验技术。英拜生物可为●您提供microRNA报告基因载∩体构建服务,并可进一步为您提供荧光素酶报告基因检测々实验服务。您只需要提供目的microRNA靶位点序列,本公司专☆业技术服务人员就可替您完成☉载体构建,为您节省大量的时间和精力。
                下图为microRNA-reporter载体表达框架示意图,具有多克隆位点,方便插入目的靶点序列。psiCHECK-2载体用于终点法的细胞裂解物检测,包含萤火虫荧光素酶基因,使海肾荧光素酶的表达水平▓归一化,令该系统更可靠、重现性更好。使用psiCHECK-2载体时,无须通过共转染进行归一化。
                        

                 
                英拜生物microRNA报告基因实验流程:
                1. microRNA靶点的预测

                利用Targetscan,miRanda,PicTar软件得到目的microRNA的预测靶★点序列(客户提供)。
                1. 获得microRNA靶点序列

                根据提供的靶序列,合成两条互补的单链DNA模板。或者,设计引物PCR扩增目的microRNA靶基因3’UTR序列。
                1. microRNA靶ζ序列克隆

                将合成的两条单链退火成双链(具有粘性末端),或将PCR产物双酶♂切,后ζ 连入经过同样双酶切的miR-reporter载体中,连接产物转化大肠杆菌DH5α。
                1. 阳性克隆鉴定。

                挑选转化的』菌落,PCR筛选含有插入片段的阳性克隆,测序验证克隆的序列√和目的microRNA靶序↙列一致。
                1. 细胞转染准备

                将含目的microRNA靶基因的报告基因载体、内参质粒和microRNA mimics或microRNA negative control共转染293T或Hela细胞。
                1. 荧光素「酶检测

                共▆转染细胞24-72h后,进行双荧光素酶检测,确定目的microRNA的靶基因。
                1. 突变实验

                构建miR-reporter载体(含突变靶位▅点的荧光素酶报告基因载体)与内参质粒、microRNA mimics或microRNA negative control共转染293T或Hela细胞。共转染细胞ㄨ24-72h后,进行双荧光素酶检测,进一步验确定目╲的microRNA的靶基因。
                1. 整理分析数据,得出结论。

                提供有microRNA靶序列的报告质粒△,以及内参和对照〓质粒各一份。甘油保存菌株各一支。附mir-reporter载体的说№明书,以及实验报告,包括载体构◆建过程,鉴定记录,测序报告,细胞转染,荧光检测。



                注:
                microRNA mimics与microRNA negative control由客户提供或由本公司代购(Dharmacon公司),也选用Pre-miR 与Pre-miR negative control(Ambion)或构建microRNA过表达载体及对照载体(本公司︽可以构建)。
                 

                 

                 

                 MicroRNA功能学实验

                • 细胞︾增殖试验

                • 细胞凋亡试验

                • 细胞周期试验

                • 细胞侵袭试验

                • 细胞♀迁移试验

                  

                服务流程:

                构建过表Ψ 达microRNA载体以及对照载体或客户提供人工合成寡核苷≡酸→转染细胞╲系→qRT-PCR检测目的MicroRNA前体的表达情况→分析目的MicroRNA与细胞⊙增殖、细胞凋亡、细胞周期、细胞侵袭、细胞迁移之间〇的调控关系→出具书面报告,qRT-PCR分◇析的原始数据

                客户提供:

                MicroRNA前体(Ambion公司)或mimic 与寡核№苷酸(即对』照前体或control mimic)及细胞系。

                公司提供:

                MicroRNA表达载体的质粒、质【粒测序图、qRT-PCR分析的〖原始数据、结果分析的书面报告。

                 

                miRNA表达检测

                        定量↑检测组织或细胞样本中的miRNA是功能研究的第一步,有助于人们进一步⌒了解 miRNA与疾病发生及发展的关系,以便为疾病的早期诊断提〗供新的思路。本公司主要通过microRNA芯片、microRNA-Seq、microRNA PCR 芯片、实时定量PCR、原位杂交等多种方法检测miRNA的表达情况。为您提供∮最优质的、全方位的技术服务。

                1、microRNA芯片≡检测服务 

                2、 microRNA PCR芯片检测服务 

                3、microRNA-Seq检测服务

                4、microRNA定量PCR 

                miRNA芯片,microRNA-Seq数据深度发掘分析∞

                a) 芯片,测序数据聚类分析

                b) microRNA靶基因预测ㄨ“TargetScanS”, “miRanda (miRBase)”,“miRGen”等数据库

                预测差异microRNA的◥所有靶基因。

                c) 靶基因GO分析

                根据Gene Ontology数据库对靶基因进⊙行功能显著分析,从而筛选显著性功能的靶基因。

                d) 靶基因pathway分析

                根据KEGG数据库对靶基因进行Pathway分类,并进行显著性分析从而○得到显著性的Pathway分类。

                e) 构建的MicroRNA与基因的调→控网络

                通过构建MicroRNA与基因的调控网络,可以从中找出hub基因及hub microRNA.

                f) microRNA 、靶基因、转录因子调控网络

                microRNA也会受到转录因子调控造成表达差异,通过系统研究转录因】子与基因间的调控关系,可以为寻找重要转录因子及重要基因提供线索。

                g) microRNA启动子分々析及甲基化位点分析

                当microRNA研究日趋火热,越来越多的研究者开始关注microRNA本身甲基化变化。MicroRNA基因的甲基化变化也是造成microRNA表达差异的重要原因。

                资料下载: microRNA靶基因验证实验.pdf 附件下载  miRNA荧光定量PCR技术服务.pdf 附件下载  

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